معرفی انواع نشانگرها : DNA يتاریخچه، متدولوژی، کاربردها
تاريخچه RFLP
RFLP اولين بار در سال 1974 به عنوان يك ماركر ژنتيكي توسطGrodzicker و همكاران براي تعيين جهش در ويروس به كار گرفته شد. استفاده ازRFLPبه عنوان ماركر بيماري ژنتيكياولين بار توسطKon و Dozy (1974) براي آناليز بيماري كم خوني داسي شكل به كار گرفته شد.Botstein و همكاران 1980تئوري پايه اين روش را براي نقشهيابي ژنهاي مرتبط با بيماري درانسان مطرح كردند. Southern روش انتقال الگويDNA و پروب (كاوشگر) از ژل بهغشاء نيتروسلولزي درRFLPرا ابداع كرد.
Backman (1986) براي اولين بار استفاده از اين نشانگر را مطرح نمود. كاربردهاي مهم همچون نقشهيابي و دستكاري مكانهاي ژنهاي كنترل كننده صفات كمي با استفاده ازRFLPدر سال1983 توسطBackman وSoller بيان گرديد. با گسترش كاربرد اين نشانگر قدرتمند چند ژن يا ژنومآناليز شدند تعدادي از گونههاي دام چون گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك و جوجه نيز با استفاده از ايننشانگر آناليز شدند
كليات تكنيك
مشخص شده است كه ژنوم موجودات به طور طبيعي داراي تفاوتهائي در رديف بازهاي خطي ميباشند اين تغييرات طبيعي كه سبب گوناگوني در افراد يك جمعيت ميشود چند شكلي ژنتيكينام دارد. اگر اين چند شكلي در رديف بازهايDNA در جايگاه شناسائي آنزيم محدودكننده ايجادشده باشند به راحتي قابل رديابي استRFLP . وجود الگوهاي غيريكسان است كه بر اثر هضمآنزيمي يك ناحيهِ خاص ازDNA بوسيلهِ آنزيمهاي محدود كننده مشخص ميشود. اين الگوهايغيريكسان به علت تفاوتDNA بسته به حضور يا عدم حضور جايگاه آنزيمهاي محدود كنندهبوجود ميآيد اين الگوها را به دو شكل ميتوان مشخص كرد .
- هضم آنزيمي و سپس الكتروفوز و استفاده از لكهگذاري ساترن
PCR فطعه مورد نظر و هضم آنزيميRFLP مستقيما روي تظاهر ژن از طريق تغيير در شكلگيريmRNA و ميزان و تعداد نسخهبرداري تاثير ميگذارد.
آنزيمهاي محدودگر
آنزيمهاي برشي دستهاي از آنزيمهاي آندو نوكلئاز به شمار ميروند كه يك رديف اختصاصي از بازها را در درون مولكولDNA دو رشتهاي شناسائي ميكنند .
در سال 1970 سويههاي معيني از باكتري كه قادرندDNA خارجي را كه وارد سلول آن شده تجزيه كنند، كشف گرديد. چون با اين آنزيمها، سويههاي ويژهاي از باكتري قادر بودند كه آلودهكنندگي فاژ يا ويروس را كاهش دهند و در واقع زمان ميزباني باكتري را محدود كنند به اسم آنزيممحدودگر ناميده ميشذتد. به دليل اهميت اين پديده و نقش كليدي آن در پيشرفت ملكولي كاشفيناين آنزيمهاي محدودگر سه نفر به اسم آلبر(Albet) )، اسميتSmith)) )، ناتنز (Nathan)بودند كه موفق به دريافت جايزهِ نوبل شدند در بيشتر مواقع توالي شناخته شده اين آنزيمها يك پاليندروم است كه معمولاإ شامل چهار شش جفت باز داراي تقارن دو طرفي است، يعني از چپ و راست به يك صورت خوانده ميشود.
زماني كه يك آنزيم برشي بهDNA اضافه ميشودDNA از بسياري از مكانها كه از آنها قبلاعنوان سايت برشي ياد شد، شكاف برميدارد و در اصطلاح هضم ميشود. حاصل فرآيند هضم،تعدادي قطعه است، در ذيل چند مثال از آنزيمهاي برشي آورده شده است:
در روشRFLP ابتدا نمونهاي ازDNAرا با يكنوع آنزيم برشي، هضم ميكنند كه در نتيجه تعداد زيادي قطعه با طول متفاوت بدست ميآيد، سپس اين قطعات با استفاده از ژل آگارز ازهمديگر جدا ميشوند شناسائي وتشخيص يك قطعهخاص با استفاده از كاوشگرها امكانپذير استكه اين عمل با استفاده از تكنيك ديگري تحت عنوان لكهگذاري ساترن صورت ميگيرد.
پروب يا كاوشگر
قطعهِ خاصي ازDNAرا كه متعلق به توالي از يك ژن خاص ياcDNA ميباشد، بوسيله آنزيمهاي برشي خاص هضم و قطعات حاصل در حاملهايي پلاسميد كه توسط همان آنزيممحدودگر برش داده شدهاند جاگذاري ميشود. اين پلاسميدها جهت تكثير و نگهداري به باكتريهايآزمايشگاهي كه اغلب اشريشا كلي هستند منتقل ميشوند. كلونهاي ياد شده توسط راديو ايزوتوپها يامواد شيميايي چون بيوتين نشاندار ميشود. در صورت وجود همگني رديف بازي مشابه بين پروبوDNA هضم شده اتصال بين اين دو برقرار خواهد گرديد.
لكهگذاريSouthern
براي انجام عمل هيبرايداسيون لازم است كه علاوه بر قطعه كاوشگر، قطعاتDNA هضم شده نيز تك رشتهاي شوند لذا ابتداDNA روي ژل آگارز كه حاوي قطعات هضم شده است درمحلولهاي قليائي مثل اوره يا فرمالدئيد يا هيدروكسيدسديم تكرشته مينمايند. سپس صفحهاي ازغشاء نيترو سلولزي را روي قسمت فوقاني ژل قرار داده و روي آن غشاء مقداري كاغذ جاذبه الرطوبهميگذارند محلول بافر تانك الكتروفوزر بوسيله فشار اسمزي كاغذ فوقاني بالا كشيده ميشود و حينعبور از ژل به غشاء نيترو سلولزي كه داراي بار مثبت است منتقل ميگردد. با تسهيل عملهيبريداسيون بين كاوشكر و قطعاتDNA هضم شده در معرض پروب نشاندار راديواكتيو در نقاطيكه همولوژي وجود دارد هيبريد ميگردد. قطعاتي كه هيبريداسيون در آنها صورت نگرفته است ازمحيط شسته ميشوند و سپس از غشاي نيترو سلولزي در مجاورت فيلم عكاسي اتوراديوگرافيبعمل ميآيد پس از ظهور و ثبوت فيلم قطعات ويژهاي ازDNA كه با پروب هيبريد هستند بهصورت يك باند مرئي ديده ميشود شكل زير مراحل انجام لكهگذاريSouthern را نشان ميدهد.مزايايRFLP عبارت است از موارد زير ميباشد:
- تحت تاءثير محيط نيست و صددرصد ژنتيكي است
- همبارز است
- تكرار پذيري آن بالاست
PCR-RFLP) PBR)
در روش دومRFLP ، ابتدا قطعه حاوي جايگاه چند شكلي را با واكنش زنجيرهِ پليمراز واستفاده از دو پرايمر مخصوص كه به همين منظور طراحي شده تكثير مينمايند و پس از هضمآنزيمي، الكتروفوز ميكنند. درPBR جهشهائي از نوع نقطهاي و حذف و اضافه كه باعث تغيير درسطح قطعه آنزيمي ميگردند قابل تشخيص است
فرق لكهگذاري ساترن وPBR
در RFLPساترن تنوعDNAدر داخل يك منطقهKb 30 محصور توسط پروب تعيين ميگردد در حاليكه درPBR تنوع در داخل منطقهاي كه از دو طرف به پرايمر ختم شده تعيينميشود اين ناحيه معمولاKb2-0.5است. علاوه بر اين درPBRمزايائي چون سادگي، سرعتزياد، عدم نياز به مواد راديواكتيو و تكرارپذيري بالا مطرح ميباشد
ميزان پليمورفيسم و تعداد آللها درPBR كمترازRFLPساترن ميباشد عباسي (1376)نشانگرPBRبراي تشخيص پليمورفيسم در ژن هورمون رشد گاوهاي هلشتاين استفادهكرد Aggreyو همكاران 1999 از ماركرPBR براي تشخيص پلي مورفيسم در ناحيهِ مجاور ژن گيرنده هورمون رشد در گاوهاي هلشتاين كانادا استفاده نمودند و الگوهاي باندي مختلفي را درروي ژل مشخص نمودند
PCR-SSCP
اين روش در سال 9891 ابداع شد. زماني كهDNAدو رشتهاي در روي ژل الكتروفوز حركت داده ميشود. حركتDNA به اندازه قطعه بستگي دارد بطوريكه مولكولهاي كوچك از منافذ ژل بهآساني عبور ميكنند. در الكتروفوزSSCPابتدا از يك مادهِ دناتوره كننده (واسرشت كننده) مانند اورهبراي تبديلDNA دو رشتهاي به تك رشتهاي استفاده ميشود.
در هنگام راندنDNA تك رشته در ژل، اثر متقابل داخل مولكولي روي ميدهد. به عبارت ديگرDNA رشته قادر است در بخشهائي با خود باند تشكيل دهد بنابراين حركت مولكولها دراين حالت بيشتر به ساختار مولكوليDNA تك رشته نيز وابسته است (ساختمان سوم)
ساختمان سوم در قطعه تك رشته وابسته به توالي كل قطعه است اگر جهش در تواليA رخ دهد ساختار قطعه تغيير مييابد. اگر پلي مورفيسم در قسمت آغازين محصولPCR باشدشناسائي آن باSSCP بسيار راحتتر است.
PCR-DGGE
DGGE يكي از روشهاي مناسب براي آشكار سازي جهشها است. اين روش بررسي فرآوردههاي زنجيره پليمراز صورت ميگيرد. در صورتيكه قطعات رشتهDNA در يك نوكلئوتيد باهم متفاوت باشند، الگوي واسرشت شده متفاوتي را نشان ميدهند. در اين روش دو نمونهDNA دردو ستون جداگانه از يك ژل پلياكريلاميد كه داراي نسبتي از غلظت ماده واسرشت كننده (معمولافرماميد) است، مورد الكتروفورز قرار ميگيرد. وقتي مولكولها به سطح بحراني دناتوره ميرسند، دورشتهDNA شروع به جدا شدن ميكنند در اين حالت كاهش معنيداري در حركت قطعات ايجادميشود. اين نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل ميكند و باعث تاءخير در حركت مولكولDNA جهشيافته نسبت به فرم وحشي ميگردد
DGGE به مواد راديواكتيو و مواد شيميائي سمي احتياج ندارد ولي ابزار پيشرفتهميخواهد درصد تعيين موتاسيون در اين روش خيلي نزديك به 100% است. نوع مشابهاي از اينروشTGGEميباشد كه در آن از حرارت بجاي غلظت مواد شيميائي در ژل استفاده ميشود. شكلهاي پيوست چگونگي انجام تكنيكDGGE را نشان ميدهد.بهترين طول قطعات برايDGGE بينbp 150-1500ميباشد. براي واسرشت شدن كامل قطعات حاصل از زنجيرهِ پليمراز از يك ناحيه حاوي بالاترين دماي ذوب مصنوعي به نامGC-clamp استفاده ميشود نمونهاي از استفاده از ماركرDGGEراي يافتن پلي مورفيسم دراگزون ده گيرندهِ هورمون رشد توسط جيGe و همكاران (1999) انجام شده است
PCR-ARMS
روشARMS روش سريعي براي تعيين جهشهاي نقطهاي و حذف و اضافهها است. اين روش اولين بار توسطNewton و)Groham 1994 (براي آناليز بازهاي متفاوت دروالدين حاوي كمبود آنتيترپيسين و همچنين براي تشخيص والدين ناقل بيماري سيستيكفيبروزيس و بتاتالاسمي بكار گرفته شد.
اين تكنيك براساس طراحي پرايمرهاي اختصاصي آللها درPCRميباشد. براي تشخيص يك جهش ويژه، دو پرايمر كنترل در نزديكي محل موتاسيون براي اطمينان از عمل صحيحPCR طراحي ميشود. براي تكثير منطقهِ حاوي جهش نيز يك پرايمر مشترك براي الل موتانت و وحشيطراحيميگردد. دو پرايمر باقي مانده همان پرايمرهايARMS ميباشد كه باز َ3 آنها بهترتيب مكمل توالي الل موتانت و الل وحشي هستند. چنانچه پرايمرARMSداراي َ3 مكملDNA الگو بود، همراه با پرايمر مشترك قطعه ما بين دو پرايمر تكثير ميگردد و ما در روي ژل دو باند رامشاهده مينمائيم.
اگر پرايمرARMSداراي َ3 مكملDNA الگو نبود، فقط يك باند در روي ژل كه حاصل تكثيرمنطقه بين دو پرايمر كنترل ميباشد، مشاهده ميگردد. زيرا انتهاي َ3 ناجور جفت شدگي دارد وباعث جلوگيري از عمل پلي مراز به جهت دور شدن َ3 آغازگر ازDNA ميشود آقائي(1376) اولين بار در ايران از اين نشانگر براي شناسائي جهشهاي ژن كاپاكازئين در گاوهاي بوميايران استفاده نمودند
AFLP
Zabeau و همكاران- 1993روش جديدي را تحت عنوان تكثير قطعات برش يافتهِ انتخاب ابداع كردند كه حاصل آنAFLP است. اين روش تركيبي ازPCR وRFLPميباشد. درسال1995،Vosو همكاران از اين روش براي انگشت نگاري ژنومهائي كه از لحاظ چند شكلي در طولقطعات حاصل از هضم، بسيار بهم نزديك بودند استفاده نمودند
مزايايAFLP
نياز به پروب ندارد
دماي اتصال پرايمر به الگو بسيار بالاست
معمولا غالب است و زماني همبارز است كه سايت برشي پلي مورفيك كاملا داخل قطعهباشد .
